Gardez-les au FROID ! Le processus de fabrication de cellules compétentes est difficile en raison de la nécessité pour les cellules de rester froides. Ceci est crucial car les cellules sont si sensibles et fragiles pendant qu'elles sont rendues compétentes Maintenir la température basse permet d'éviter la mort cellulaire pendant le traitement.
Pourquoi les réactions sont-elles conservées sur de la glace pendant l'expérience de transformation ?
Le mélange plasmide-cellule est ensuite brièvement chauffé à 45–50°C, permettant à l'ADN de pénétrer dans la cellule à travers la membrane rompue. Le mélange chauffé est ensuite replacé sur de la glace pour retenir les plasmides à l'intérieur des bactéries … Si la solution d'ADN plasmidique contient trop de sel, un arc électrique peut se produire, compromettant la transformation.
Pourquoi placez-vous les tubes sur de la glace ?
Pourquoi pensez-vous que nous mettons les tubes sur la glace ? Pour introduire l'ADN dans les bactéries, nous devons y percer des trous avec le chlorure de calcium chimique (CaCl2). … Les trous percés pour permettre à l'ADN de laisser la bactérie fuir. Si nous ne les gardons pas dans la glace, ils "saigneront" à mort.
Quel est le rôle du chlorure de calcium glacé dans la préparation de cellules compétentes ?
Le processus de transformation par choc thermique du chlorure de calcium encourage les cellules bactériennes à absorber l'ADN du milieu environnant. … La solution de CaCl2 glacée facilite la liaison de l'ADN à la surface de la cellule, qui pénètre ensuite dans la cellule après une courte période de choc thermique (3).
Comment stocker les cellules compétentes ?
Les cellules compétentes doivent être conservées à - 80°C. Le stockage à -20°C entraînera une diminution significative de l'efficacité de transformation (TE). Lorsqu'elles ont été testées sur NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB C2987H), les cellules ont perdu 94,5 % de TE après seulement 24 heures de stockage à -20 °C.
